{"id":13608,"date":"2016-03-09T18:23:03","date_gmt":"2016-03-09T18:23:03","guid":{"rendered":"https:\/\/cnpem.staging.wpengine.com\/?p=13608"},"modified":"2022-01-21T16:05:52","modified_gmt":"2022-01-21T19:05:52","slug":"uma-ferramenta-para-editar-o-dna","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cnpem.br\/uma-ferramenta-para-editar-o-dna\/","title":{"rendered":"Uma ferramenta para editar o DNA"},"content":{"rendered":"

Revista Pesquisa FAPESP em Fevereiro\/2016<\/p>\n

Sistema copiado de bact\u00e9rias, CRISPR-Cas9 pode catalisar descobertas em biologia e medicina e suscita temores \u00e9ticos<\/p>\n

Um sistema que permite a bact\u00e9rias reconhecer e combater invas\u00f5es virais promete uma novidade significativa na gen\u00e9tica. Trata-se de uma prote\u00edna guiada por uma mol\u00e9cula de RNA que corta as fitas de DNA em pontos espec\u00edficos e ativa vias de reparo. No Brasil, v\u00e1rios pesquisadores j\u00e1 se preparam para incorporar \u00e0s suas linhas de\u00a0pesquisa a t\u00e9cnica criada em 2012<\/a>. \u00c9 uma hist\u00f3ria que est\u00e1 no in\u00edcio e por enquanto rendeu poucos resultados palp\u00e1veis. Vale a pena ficar de olho, tanto pelo que o sistema tem de promissor quanto pelo potencial de alterar genes humanos e produzir beb\u00eas sob medida, o que suscita cautela a ponto de se discutir uma morat\u00f3ria ao seu uso.<\/p>\n

\"038-041_Crispr_240\"<\/a><\/p>\n

\u201c\u00c9 um grande equalizador, at\u00e9 n\u00f3s conseguimos fazer\u201d, brinca o m\u00e9dico Jos\u00e9 Xavier Neto, do Laborat\u00f3rio Nacional de Bioci\u00eancias (LNBio), em Campinas, sobre o sistema que ficou conhecido como CRISPR-Cas9. A sigla significa Conjunto de Repeti\u00e7\u00f5es Palindr\u00f4micas Regularmente Espa\u00e7adas, que funciona com uma prote\u00edna associada, a Cas. A CRISPR-Cas9 pode ser inserida em c\u00e9lulas usando v\u00edrus ou por meio de inje\u00e7\u00f5es de DNA nas fases iniciais de um embri\u00e3o. Uma mol\u00e9cula de RNA sintetizada especialmente serve de guia para atingir o gene que se pretende alterar (ver infogr\u00e1fico<\/a>).<\/em>\u00a0S\u00e3o procedimentos ao alcance da maior parte dos laborat\u00f3rios de gen\u00e9tica, o que confere autonomia aos pesquisadores.<\/p>\n

No laborat\u00f3rio de Xavier tudo come\u00e7ou com \u00c2ngela Saito, que \u00e0 \u00e9poca fazia doutorado sob orienta\u00e7\u00e3o do bi\u00f3logo J\u00f6rg Kobarg, na Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), e precisava produzir um roedor com defici\u00eancia na produ\u00e7\u00e3o de uma determinada prote\u00edna (nocaute) para estudar seu papel na leucemia. Nas bancadas de Xavier, ela come\u00e7ou o tedioso processo tradicional, em que \u00e9 preciso gerar e rastrear as manipula\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas em centenas de clones de c\u00e9lulas-tronco embrion\u00e1rias. Para aprender a fazer esse trabalho de escala quase industrial ela foi, ainda durante o doutorado, ao Centro de C\u00e2ncer MD Anderson da Universidade do Texas, onde acabou aprendendo a nova t\u00e9cnica com o geneticista norte-americano Richard Behringer. Voltou ao laborat\u00f3rio paulista trazendo na bagagem os vetores que injetaria nos embri\u00f5es de camundongos para produzir os nocautes que necessitava. Deu certo: \u00c2ngela ensinou os colegas e, em pouco mais de um ano, o laborat\u00f3rio j\u00e1 produziu nocautes para quatro genes diferentes.<\/p>\n

Combate a doen\u00e7as<\/strong>
\nO pote\"Crispr_RatoFundo1\"ncial da CRISPR-Cas9 na pesquisa de agentes causadores de doen\u00e7as tamb\u00e9m atraiu os parasitologistas venezuelanos Noelia Lander e Miguel Chiurillo, interessados em estudar o parasita\u00a0Trypanosoma cruzi<\/em>, causador da doen\u00e7a de Chagas, e quem sabe contribuir para o desenvolvimento de terapias alternativas. Atualmente em est\u00e1gio de p\u00f3s-doutorado na Faculdade de Ci\u00eancias M\u00e9dicas da Unicamp em colabora\u00e7\u00e3o com os bioqu\u00edmicos An\u00edbal Vercesi e Roberto Docampo, argentino que \u00e9 professor na Universidade da Ge\u00f3rgia, nos Estados Unidos, e atua como professor visitante na universidade do interior paulista, Noelia j\u00e1 mostrou\u00a0que consegue alterar genes em artigo de 2015 na revista\u00a0mBio<\/em>. Ela avariou genes ligados ao flagelo dos parasitas \u2013 a estrutura semelhante a uma cauda que lhes permite locomover-se. \u201c\u00c9 um fen\u00f3tipo muito f\u00e1cil de enxergar, porque o flagelo se separa do corpo celular e o parasita fica depositado no fundo da garrafa\u201d, explica. A prova de conceito \u00e9 uma vit\u00f3ria porque os tripanossomos t\u00eam se mostrado muito eficazes em resistir a qualquer tentativa de manipula\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica. Agora, nos estudos com genes envolvidos na sinaliza\u00e7\u00e3o celular por c\u00e1lcio, vem a parte que pode ajudar no combate a essa doen\u00e7a que carece de tratamento eficaz na fase cr\u00f4nica. \u201cOs n\u00edveis de c\u00e1lcio mudam muito quando o parasita infecta o hospedeiro\u201d, explica. \u201cSe conseguirmos mexer nessas prote\u00ednas, que s\u00e3o diferentes entre o parasita e o hospedeiro vertebrado, pode ser o caminho para uma terapia alternativa.\u201d<\/p>\n

O combate \u00e0 transmiss\u00e3o da dengue \u00e9 o objetivo do bi\u00f3logo Jayme de Souza-Neto, do\u00a0campus\u00a0<\/em>de Botucatu da Universidade Estadual Paulista (Unesp). No mosquito\u00a0Aedes aegypti<\/em>, ele comparou os RNAs transcritos de mosquitos infectados e resistentes ao v\u00edrus em popula\u00e7\u00f5es naturais em Botucatu, interior paulista, e Ne\u00f3polis, em Sergipe, e identificou genes que podem estar ligados \u00e0 resist\u00eancia. \u201cEstamos come\u00e7ando a fazer as muta\u00e7\u00f5es nos genes dos mosquitos\u201d, relata. At\u00e9 julho, ele pretende ter no laborat\u00f3rio popula\u00e7\u00f5es nas quais poder\u00e1 verificar se a suscetibilidade ao v\u00edrus foi alterada. Ainda longe no horizonte, a ideia \u00e9 produzir mosquitos resistentes, que por n\u00e3o serem infectados tamb\u00e9m n\u00e3o transmitem a doen\u00e7a aos seres humanos. O projeto tem avan\u00e7ado no \u00e2mbito da colabora\u00e7\u00e3o estabelecida entre a FAPESP, a Unesp e a Universidade de Keele, no Reino Unido (ver\u00a0<\/em>Pesquisa FAPESP\u00a0n\u00ba 230<\/em><\/a>). Souza-Neto passou tr\u00eas meses no laborat\u00f3rio de Julien Pelletier, que esteve em Botucatu por quatro meses. \u201cEm abril ele deve voltar para come\u00e7armos as inje\u00e7\u00f5es nos embri\u00f5es de mosquitos\u201d, planeja o pesquisador.<\/p>\n

A bi\u00f3loga Nat\u00e1lia Gon\u00e7alves est\u00e1 lidando com sujeitos maiores: c\u00e3es da ra\u00e7a\u00a0golden retriever<\/em>\u00a0usados como modelo para estudos da distrofia muscular de Duchenne, uma doen\u00e7a degenerativa que acaba impedindo os pacientes de andar e comer (ver\u00a0<\/em>Pesquisa FAPESP\u00a0n\u00ba 237<\/em><\/a>). Durante o doutorado ela estabeleceu linhagens de c\u00e9lulas reprogramadas (c\u00e9lulas-tronco de pluripot\u00eancia induzida, ou iPSCs) a partir de c\u00e9lulas da pele dos c\u00e3es. Agora, no est\u00e1gio de p\u00f3s-doutorado sob supervis\u00e3o de Carlos Eduardo Ambr\u00f3sio, da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de S\u00e3o Paulo (FZEA-USP), pretende estabelecer a linhagem com c\u00e9lulas de c\u00e3es distr\u00f3ficos e corrigir o gene defeituoso para produ\u00e7\u00e3o da prote\u00edna distrofina em parceria com o geneticista franc\u00eas Jean-Paul Concordet, do Museu Nacional de Hist\u00f3ria Natural, em Paris. \u201cJ\u00e1 sabemos qual regi\u00e3o do gene est\u00e1 faltando, ent\u00e3o a ideia \u00e9 produzir esse pedacinho e inseri-lo\u201d, planeja. Ela tem muito trabalho pela frente: enquanto a t\u00e9cnica para inativar genes com CRISPR-Cas9 j\u00e1 est\u00e1 razoavelmente dominada, o sucesso na inser\u00e7\u00e3o de trechos espec\u00edficos ainda \u00e9 baixo.<\/p>\n

A geneticista Maria Rita Passos Bueno, do Instituto de Bioci\u00eancias da USP (IB-USP), tamb\u00e9m aposta na edi\u00e7\u00e3o do DNA para estudar doen\u00e7as humanas com a ajuda da pesquisadora Erika Kague, que aprendeu a t\u00e9cnica no final do est\u00e1gio de p\u00f3s-doutorado na Universidade da Pensilv\u00e2nia, nos Estados Unidos. O doutorando Luciano Abreu Brito estabeleceu uma linhagem de peixe-paulistinha, o zebrafish (ver\u00a0<\/em>Pesquisa FAPESP\u00a0n\u00ba 209<\/em><\/a>), para estudar fissura de l\u00e1bio palatino. \u201cEncontramos a muta\u00e7\u00e3o por sequenciamento em pacientes, agora posso inserir no peixe para testar se \u00e9 mesmo relevante para a doen\u00e7a\u201d, conta. Em c\u00e9lulas humanas isoladas, a doutoranda Danielle Moreira inseriu muta\u00e7\u00f5es ligadas ao autismo. No futuro, ela pretende usar iPSCs que possam dar origem a neur\u00f4nios, para verificar se as altera\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas identificadas em pacientes alteram o funcionamento de c\u00e9lulas nervosas.<\/p>\n

Lygia da Veiga Pereira, geneticista do IB-USP, tamb\u00e9m est\u00e1 come\u00e7ando a alterar diretamente c\u00e9lulas humanas. Sua aluna de mestrado Juliana Sant\u2019Ana est\u00e1 em contato com o geneticista Chad Cowan, da Universidade Harvard, nos Estados Unidos, para aprender como utilizar o CRISPR-Cas9. A ideia \u00e9 provocar no gene da prote\u00edna fibrilina a muta\u00e7\u00e3o t\u00edpica da s\u00edndrome de Marfan. Uma vez bem-sucedida em c\u00e9lulas de f\u00e1cil cultivo, Lygia pretende passar \u00e0 linhagem de c\u00e9lulas-tronco desenvolvida em seu laborat\u00f3rio, a BR-1 (ver\u00a0<\/em>Pesquisa FAPESP\u00a0n\u00ba 153<\/em><\/a>). \u201cQuero produzir c\u00e9lulas card\u00edacas e c\u00e9lulas de osso com a muta\u00e7\u00e3o\u201d, planeja. A facilidade de trabalhar com a CRISPR-Cas9 permite passar por essa fase com relativa rapidez e chegar ao que interessa: o estudo de como a doen\u00e7a se comporta em diferentes tecidos. \u201cA ci\u00eancia vai come\u00e7ar quando pudermos comparar essas c\u00e9lulas.\u201d<\/p>\n

Estrutura proteica<\/strong>
\nMaria Rita explica que o conhecimento sobre o sistema CRISPR-Cas9 est\u00e1 avan\u00e7ando rapidamente na busca por uma exatid\u00e3o cada vez maior na edi\u00e7\u00e3o. Uma das frentes agora exploradas por Jennifer Doudna, da Universidade da Calif\u00f3rnia em Berkeley, uma das protagonistas no desenvolvimento da t\u00e9cnica, \u00e9 desvendar como a estrutura da prote\u00edna permite que ela se encaixe no DNA e o corte em um ponto espec\u00edfico, conforme mostra artigo publicado em janeiro na revista\u00a0Science<\/em>.<\/p>\n

\"Crispr_bebesFundo\"<\/a><\/p>\n

O bioqu\u00edmico teuto-chileno Martin W\u00fcrtele, da Universidade Federal de S\u00e3o Paulo (Unifesp), j\u00e1 se dedicava a desvendar a estrutura tridimensional dessas prote\u00ednas antes mesmo da descoberta de Jennifer e sua colega francesa Emmanuelle Charpentier, do Instituto Max Planck de Biologia da Infec\u00e7\u00e3o, Alemanha, em 2012. \u201cCome\u00e7amos a trabalhar h\u00e1 uns cinco anos com diversas prote\u00ednas CRISPR-Cas por sua contribui\u00e7\u00e3o para a prote\u00e7\u00e3o das bact\u00e9rias contra os seus principais inimigos naturais, os fagos, e pela possibilidade de se fazer edi\u00e7\u00e3o no DNA\u201d, conta. \u201cMas de l\u00e1 pra c\u00e1 descobriram a Cas9, que, ao contr\u00e1rio dos sistemas CRISPR-Cas com que trabalhamos, faz praticamente todo o processo com uma \u00fanica prote\u00edna e \u00e9 um candidato s\u00e9rio ao Pr\u00eamio Nobel.\u201d Ele revelou que uma prote\u00edna chamada Csm2, retirada de uma bact\u00e9ria, \u00e9 formada por uma longa cadeia de amino\u00e1cidos em h\u00e9lice, circundada por tr\u00eas h\u00e9lices mais curtas. \u201cA prote\u00edna Csm2 \u00e9 completamente diferente das descritas em outros complexos\u201d, conta W\u00fcrtele. Para ele, essa prote\u00edna \u00e9 parte de uma defesa importante da bact\u00e9ria e o conhecimento de como funciona pode vir a ser usado contra as pr\u00f3prias bact\u00e9rias. \u201cH\u00e1 um interesse muito grande de usar fagos como potenciais substitutos de antibi\u00f3ticos.\u201d<\/p>\n

As aplica\u00e7\u00f5es s\u00e3o tantas que a possibilidade de editar genes humanos gera temores. Por enquanto est\u00e1 garantida a continuidade das pesquisas, com a proposta de se proibir a implanta\u00e7\u00e3o de embri\u00f5es humanos alterados. Muitos pesquisadores revelam preocupa\u00e7\u00e3o, mas Jos\u00e9 Xavier Neto n\u00e3o acredita em um risco real. \u201cOs malef\u00edcios de se sobrepor \u00e0 evolu\u00e7\u00e3o podem ser muito maiores que os benef\u00edcios\u201d, alerta. \u201cA possibilidade de efeitos\u00a0off target<\/em>\u00a0[n\u00e3o previstos] pode fazer com que se atire no que se viu e acerte o que n\u00e3o se viu, produzindo beb\u00eas \u2018programados\u2019 para apar\u00eancia ou desempenho, mas com leucemia ou problemas piores.\u201d Contra isso existem mecanismos de controle como comit\u00eas de \u00e9tica e, no Brasil, a Lei de Biosseguran\u00e7a, que pro\u00edbe a engenharia gen\u00e9tica em embri\u00f5es humanos. O Reino Unido decidiu: em 1\u00ba de fevereiro autorizou a edi\u00e7\u00e3o de genes em c\u00e9lulas humanas no \u00e2mbito de pesquisa cient\u00edfica.<\/p>\n

Projetos<\/strong>
\n1.<\/strong>\u00a0Gera\u00e7\u00e3o de camundongo nocaute para o receptor nuclear \u00f3rf\u00e3o Coup-TFII: Investiga\u00e7\u00e3o dos mecanismos moleculares que determinam a express\u00e3o atrial-espec\u00edfica do promotor do gene SMyHC3 (n\u00ba 2015\/10166-9<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Bolsa no Pa\u00eds \u2013 P\u00f3s-doutorado;\u00a0Pesquisador respons\u00e1vel<\/strong>\u00a0Jos\u00e9 Xavier Neto (CNPEM); Bolsista \u00c2ngela Saito (CNPEM);\u00a0Investimento\u00a0<\/strong>R$ 169.558,00.
\n2.<\/strong>\u00a0Sinaliza\u00e7\u00e3o por \u00edons de c\u00e1lcio em tripanossomat\u00eddeos (n\u00ba 2013\/50624-0<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Aux\u00edlio \u00e0 Pesquisa \u2013 Programa SPEC;\u00a0Pesquisador respons\u00e1vel<\/strong>Roberto Docampo (Unicamp);\u00a0Investimento<\/strong>\u00a0R$ 1.955.088,00.
\n3.<\/strong>\u00a0Edi\u00e7\u00e3o g\u00eanica por CRISPR-Cas9 na corre\u00e7\u00e3o da Distrofia Muscular de Duchenne no modelo canino (GRMD) a partir de c\u00e9lulas de pluripot\u00eancia induzidas (n\u00ba 2015\/09575-1<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Bolsa no Pa\u00eds \u2013 P\u00f3s-doutorado;\u00a0Pesquisador respons\u00e1vel<\/strong>\u00a0Carlos Eduardo Ambr\u00f3sio (USP);\u00a0Bolsista<\/strong>\u00a0Natalia Juliana Nardelli Gon\u00e7alves (USP);\u00a0Investimento\u00a0<\/strong>R$ 169.558,00.
\n4.<\/strong>\u00a0Caracteriza\u00e7\u00e3o dos mecanismos de a\u00e7\u00e3o antidengue mediados pela microbiota intestinal de popula\u00e7\u00f5es naturais do mosquito\u00a0Aedes aegypti<\/em>\u00a0(n\u00ba 2013\/11343-6<\/a>)\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Aux\u00edlio \u00e0 Pesquisa \u2013 Jovens Pesquisadores;\u00a0Pesquisador respons\u00e1vel<\/strong>Jayme Augusto de Souza-Neto (Unesp);\u00a0Investimento<\/strong>\u00a0R$ 2.209.619,50.
\n5.<\/strong>\u00a0Gera\u00e7\u00e3o de muta\u00e7\u00f5es no gene FBN1 em C\u00e9lulas-Tronco Pluripotentes Induzidas (iPSCs) utilizando o sistema CRISPR-Cas9 (n\u00ba 2015\/01339-7<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Bolsa no Pa\u00eds \u2013 Mestrado \/ Capes;\u00a0Pesquisadora respons\u00e1vel<\/strong>\u00a0Lygia da Veiga Pereira Carramaschi (USP);\u00a0Bolsista<\/strong>\u00a0Juliana Borsoi Sant\u2019Ana (USP);\u00a0Investimento\u00a0<\/strong>R$ 38.823,80.
\n6.<\/strong>\u00a0An\u00e1lise gen\u00f4mica para a compreens\u00e3o dos mecanismos gen\u00e9ticos etiol\u00f3gicos das fissuras labiopalatinas na popula\u00e7\u00e3o brasileira (n\u00ba 2011\/23416-2<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Bolsa no Pa\u00eds \u2013 Doutorado;\u00a0Pesquisadora respons\u00e1vel<\/strong>\u00a0Maria Rita dos Santos e Passos Bueno (USP);\u00a0Bolsista<\/strong>\u00a0Luciano Abreu Brito (USP);\u00a0Investimento\u00a0<\/strong>R$ 146.770,80.
\n7.<\/strong>\u00a0Biologia estrutural de prote\u00ednas processadoras de \u00e1cidos nucleicos em bact\u00e9rias com elevada relev\u00e2ncia biom\u00e9dica (n\u00ba 2011\/50963-4<\/a>);\u00a0Modalidade<\/strong>\u00a0Aux\u00edlio \u00e0 Pesquisa \u2013 Regular;\u00a0Pesquisador respons\u00e1vel<\/strong>\u00a0Martin Rodrigo Alejandro W\u00fcrtele Alfonso (Unifesp);\u00a0Investimento<\/strong>\u00a0R$ 496.766,00.<\/p>\n

Artigos cient\u00edficos<\/em>
\nJIANG, F.\u00a0et al.<\/em>\u00a0Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage<\/a>.\u00a0Science<\/strong>. On-line. 14 jan. 2016.
\nLANDER, N.\u00a0et al<\/em>.\u00a0CRISPR-Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in\u00a0Trypanosoma cruzi<\/em>\u00a0reveals their role in flagellar attachment<\/a>.\u00a0mBio<\/strong>. v. 6, n. 4, e01012-15. jul-ago. 2015.
\nGALLO, G.\u00a0et al.<\/em>\u00a0Structural basis for dimer formation of the CRISPR-associated protein Csm2 of Thermotoga maritima<\/a>.\u00a0FEBS Journal<\/strong>. on-line. 10 dez. 2015.
\nGALLO, G.\u00a0et al<\/em>.\u00a0Purification, crystallization, crystallographic analysis and phasing of the CRISPR-associated protein Csm2 from Thermotoga maritima.\u00a0<\/a>Structural Biology Communications<\/strong>. F71, p. 1223-27. out. 2015.<\/p>\n

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